免疫共沉淀（Co-IP）實驗，你真的做對了嗎？

免疫共沉淀（Co-IP）技術，相信大家都不陌生，它是一項通過特異性抗體靶向結合目標蛋白，利用瓊脂糖珠或磁珠捕獲抗原-抗體復合物，經(jīng)溫和裂解細胞后，通過離心分離并富集與目標蛋白直接或者間接結合的相互作用蛋白，最終通過免疫印跡（WB）或質譜技術鑒定復合物成分，從而解析蛋白質相互作用網(wǎng)絡的重要實驗技術。

今天就和長沙實驗外包公司慧登生物實驗室，一起學習下究竟免疫共沉淀（Co-IP）實驗到底怎么做吧！

實驗步驟：

1、材料準備

①預冷PBS、細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑）、Protein A/G磁珠、特異性抗體、IgG對照抗體、洗滌緩沖液、SDS上樣緩沖液。

②細胞處理:用預冷PBS清洗細胞2次，刮刀收集細胞，離心后棄上清。

2、細胞裂解與蛋白提取

①裂解細胞:加入細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上靜置30分鐘，每10分鐘震蕩混勻。

②離心收集上清:1.4℃，12,000 rpm離心10分鐘，收集蛋白裂解液。

③保留Input對照:取少量裂解液（如4.5 μL）作為陽性對照（Input組）。 

3、抗體與磁珠偶聯(lián)

①預處理磁珠:用洗滌緩沖液清洗磁珠2次，棄上清。

②抗體偶聯(lián):加入特異性抗體（如3-5 μg），室溫旋轉孵育30分鐘。

③洗滌磁珠:用洗滌緩沖液清洗磁珠2次，棄上清。

4、免疫沉淀反應

①孵育過夜：將抗體偶聯(lián)的磁珠加入蛋白裂解液，4℃旋轉孵育過夜。

②設置IgG對照:用非特異性IgG抗體重復上述步驟，長沙實驗外包公司慧登生物實驗室提醒，這樣做得目的是為了排除假陽性。

3、洗滌與純化

①離心沉淀磁珠：1.4℃，3,000 rpm離心3分鐘，棄上清。

②洗滌去除非特異蛋白:用洗滌緩沖液清洗磁珠3-4次，棄上清。 

4、蛋白洗脫與檢測

①洗脫蛋白:加入SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5-10分鐘。

②SDS-PAGE分離:制備凝膠，上樣后電泳分離蛋白。

③Western Blotting檢測:用靶蛋白抗體檢測沉淀復合物中的目標蛋白。

長沙實驗外包公司慧登生物實驗室提醒，實驗中這些問題要注意：

①使用特異性強的單克隆抗體，驗證抗體在不表達抗原的細胞裂解液中無共沉淀。

②避免高濃度變性劑（如0.2% SDS），裂解液需含蛋白酶抑制劑。

③必須設置Input對照（總蛋白）和IgG對照（排除非特異結合）。

④新鮮制備裂解液，避免反復凍融；洗滌時輕柔操作，避免吸走磁珠。

好了，關于免疫共沉淀（Co-IP）實驗的具體操作步驟和注意事項，今天就說這些了，如果大家還有不明白的或者是需要實驗協(xié)助指導的，可以直接咨詢長沙實驗外包公司慧登生物實驗室客服老師哦！