免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果老是達(dá)不到預(yù)期，怎么辦？

自己做免疫組化 (IHC) 實(shí)驗(yàn)老是出問(wèn)題，這是為什么�。科鋵�(shí)，不成功的原因會(huì)有很多，需要具體問(wèn)題具體分析，今天，我們就和長(zhǎng)沙實(shí)驗(yàn)外包公司慧登生物實(shí)驗(yàn)室一步步來(lái)看看！

一般的話，IHC實(shí)驗(yàn)流程包括樣本固定、包埋、切片、脫蠟水化、抗原修復(fù)、滅活、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色、復(fù)染、封片觀察 12 個(gè)部分。

1、樣本固定

步驟：

1）取材：對(duì)于組織塊，不宜過(guò)大；（用生理鹽水或 PBS 沖洗掉雜質(zhì)，比如血液、體液）；

2）固定：將組織樣本放入固定液中，（長(zhǎng)沙實(shí)驗(yàn)外包公司慧登生物實(shí)驗(yàn)室提醒，一般固定液的量通常為組織體積的 10-20 倍，確保組織能夠充分浸入固定液中）， 固定時(shí)間根據(jù)組織類型和實(shí)驗(yàn)要求而定，一般固定時(shí)間室溫 18-24 h；

3）固定完成后，取出用流水沖洗，去除殘留的固定液和可能產(chǎn)生的結(jié)晶。

2、包埋

步驟：

1）脫水：酒精梯度脫水；

2）透明：使用透明劑（長(zhǎng)沙實(shí)驗(yàn)外包公司慧登生物實(shí)驗(yàn)室建議用二甲苯）來(lái)去除其中的酒精和其他溶劑，使組織樣本變得透明；

3）浸蠟：將透明后的組織樣本放入熔化的石蠟中，讓石蠟充分滲透到組織樣本中；

4）包埋：將浸蠟后的組織樣本放入模具中，倒入熔化的石蠟，然后讓石蠟冷卻凝固。

3、切片

步驟：

1）包埋后的組織塊已經(jīng)充分冷卻并固化，使用切片機(jī)進(jìn)行切片；

2）接著，將切好的組織切片從刀上取下，并放在溫水 (40℃) 中展開(kāi)；最后再烤片機(jī)60℃ 烤片 2 h。

4、脫蠟水化

步驟：

1）脫蠟：切片首先被置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除切片上的石蠟；

2）水化：依次置于無(wú)水乙醇 I、無(wú)水乙醇 II，95% 乙醇、85% 乙醇和 70% 乙醇中，各浸泡 1 次，5 min/ 次；再放入純化水中清洗浸泡 5 min。長(zhǎng)沙實(shí)驗(yàn)外包公司慧登生物實(shí)驗(yàn)室提醒，在整個(gè)脫蠟水化過(guò)程中，應(yīng)確保切片始終保持在濕潤(rùn)的狀態(tài)，不然容易出現(xiàn)高背景染色。

5、抗原修復(fù)

抗原修復(fù)的方法：這有微波熱、水浴、高壓熱修復(fù)等多種方法。

6、滅活

7、封閉

步驟：

1）非特異位點(diǎn)封閉：將封閉液 (如 5% BSA 或血清等) 滴加到組織切片上，長(zhǎng)沙實(shí)驗(yàn)外包公司慧登生物實(shí)驗(yàn)室提醒，確保封閉液均勻覆蓋整個(gè)組織區(qū)域。然后將切片放入濕盒中，在室溫或 37°C 下孵育 30 min，讓封閉液與組織切片充分作用；

2）洗滌：封閉結(jié)束后，用 PBS 或 TBS 等緩沖液洗滌切片，以去除未結(jié)合的封閉液和可能存在的雜質(zhì)。

8、一抗孵育

步驟：

1）選擇一抗：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇特異性高、親和力強(qiáng)的一抗；

2）稀釋一抗：用適當(dāng)?shù)南♂屢?(如 PBS、TBS 等) 稀釋一抗；

3）涂覆一抗：將稀釋好的一抗均勻涂覆在已封閉的組織切片上，確�？贵w能夠充分接觸組織切片上的抗原；

4）孵育：將稀釋好的一抗均勻滴加在已封閉的組織切片上，放入濕盒中，室溫 (或 37°C) 孵育 1 h，使一抗與抗原充分結(jié)合。

9、二抗孵育

步驟：

1) 稀釋二抗：用封閉液或其他適當(dāng)?shù)娜芤合♂尪�抗�?/p>

2) 孵育二抗：將稀釋好的二抗滴加在已經(jīng)過(guò)一抗孵育并洗滌的組織切片上，室溫孵育 30 min-60 min；

3) 洗滌：孵育完成后，使用洗滌液 (如 PBST 或 TBST) 在搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌切片，以去除未結(jié)合的二抗和其他雜質(zhì)。洗滌通常需要重復(fù)幾次，每次洗滌時(shí)間一般為 5-10 分鐘。

10、顯色

加入酶的底物，底物在酶的作用下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成有色沉淀物。

11、復(fù)染

滴加 80-100 μL 蘇木素染色液至完全覆蓋組織，室溫孵育 5 min，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。

12、封片觀察

步驟：

1）脫水：切片依次使用 70%、85%、95% 乙醇、無(wú)水乙醇 I、無(wú)水乙醇 Ⅱ 分別浸泡 1 min；

2）透明：使用二甲苯浸泡兩次，每次 1 min；

3）封片：封片劑 (如中性樹(shù)膠、甘油明膠等) 滴在組織切片上，然后用蓋玻片輕輕覆蓋，長(zhǎng)沙實(shí)驗(yàn)外包公司慧登生物實(shí)驗(yàn)室提醒，封片時(shí)要確保沒(méi)有氣泡產(chǎn)生，并且蓋玻片與切片之間緊密貼合；

4）干燥。

好了，以上就是免疫組化 (IHC) 的實(shí)驗(yàn)步驟了，如果大家還有不明白的或者是需要實(shí)驗(yàn)協(xié)助指導(dǎo)的，也可以直接咨詢長(zhǎng)沙實(shí)驗(yàn)外包公司慧登生物實(shí)驗(yàn)室客服老師哦！